对肿瘤的早期诊断和判断有无转移、复发一直是困扰临床医生的难题，临床科学家不断在努力探索。近年来检测外周血中来自于肿瘤的不同类型的分子标志物，即液体活检得到飞速发展和广泛应用。在当前"精准医疗"概念席卷全球的背景下，液体活检有望引领医学研究和临床实践进入全新的时代。
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤。随着经济水平的提升、饮食结构的西方化，我国结直肠癌发病率和病死率有逐年攀升的趋势，目前已经成为我国第三大常见恶性肿瘤。数据显示大部分经过有效治疗的早期结直肠癌患者5年生存率超过90%。另约有25%的患者在初诊时已确认发生局部或者远处转移，5年生存率仅12%，且生存质量较低。因此无论是开展有效的早期结直肠癌筛查，还是针对转移性结直肠癌(mCRC)选择合适的药物治疗方案，均至关重要。
在临床倡导一级预防即从源头遏制结直肠癌发生的同时，如果将液体活检应用于结直肠癌的二级预防，并对可行切除术的患者改善术后的复发监测，为不可切除的携瘤患者选择合适且有效的个体化治疗方案以延缓病情的发展，必然有利于改善结直肠癌患者的生存质量及预后。
一. 液体活检在结直肠癌诊疗中的应用
血浆中的循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTCs)和外泌体是目前液体活检的主要靶标。其中ctDNA和CTCs凭借较为丰富的研究基础正迅速为临床接受并采用。相较组织标本，血液样本具有取材便捷、易于重复和反应肿瘤全貌等优越特性。结合现有临床实践以及不断深入的基础研究，针对血液中循环分子标志物的液体活检策略在临床诊疗中将有巨大的应用前景。
1．液体活检应用于结直肠癌早期诊断
结直肠癌的发生演变途径主要有腺瘤-腺癌途径、炎症-癌途径及新发三种。针对合并有早期危险因素的患者以有效技术实现早诊早治，可有助于改善预后。临床常用的实验室检查项目主要有粪便隐血检测、血浆蛋白标志物检测(如CEA、CA199)，虽操作简便易行，但灵敏度和特异性仍显不足。影像学检查虽有助于病变范围及分期的评估，但难以辨别早期病变。内镜检查联合组织活检仍是目前结直肠癌早期诊断的金标准，但由于检查准备烦琐使得患者依从性不足。
基于循环分子标志物的液体活检为结直肠癌早期诊断开拓了视野。研究发现结直肠癌发病与基因异常甲基化密切相关，检测基因甲基化水平有助提示肿瘤的发生。Lofton-Day等发现Septin9 DNA甲基化(mSEPT9)与结直肠癌的发生相关，并建立了血浆mSEPT9的检测方法，显示其在结直肠癌早期诊断中的应用潜力。此后多项国内外临床研究证实血浆mSEPT9适用于结直肠癌早期诊断，其诊断灵敏度为79.3%～95.6%，特异性为84.8%～99.0%。一项观察性筛查研究显示，63%观察对象拒绝内镜检查而选择无创筛查方法，血浆mSEPT9检测占其中83%，粪便隐血检测占15%。可见筛查方法的选择应****************顾目标人群的适应禁忌证与依从性。就分析前影响因素而言，循环分子标志物检测可一定程度地避免诸如肠镜检查前准备不足、粪便标本采集不当等情形对检查结果所产生的影响。
尽管血浆mSEPT9检测已进入临床作为结直肠癌筛查项目，其单独应用时对进展期腺瘤的检出率仍有不足。因此可考虑采用与结直肠癌发生发展相关的"多靶标Panel"或联合粪便DNA检测以提高检出灵敏度。此外，外周血中较为稳定的miRNA(如miR-21、miR-92a和miR-17-3p等)及血清核小体标志物亦经研究报道具有一定的临床诊断应用价值。
2．液体活检应用于结直肠癌手术预后判断及复发监测
肿瘤患者体内循环游离DNA(cfDNA)除正常细胞来源外，部分为肿瘤细胞凋亡、坏死或主动分泌释放入外周血，即ctDNA。ctDNA水平与肿瘤负荷及分期相关，结合结直肠癌分子特征监测ctDNA定基因突变位点、异常甲基化和拷贝数变异水平的变化等可用于评价肿瘤治疗效果、微小残留病灶，并作为预后评估指标，较现有临床常用的CEA、CA199等血浆蛋白标志物具有更好的灵敏度和特异性。但在实际应用中，治疗对ctDNA水平的影响及个体间cfDNA水平基础差异对检测结果的判读与诊断结论的制定具有显著影响，值得进一步研究。
与ctDNA相比，CTCs在液体活检领域中的应用起步更早。根据种子-土壤学说，游离在外周血中具备干性的CTCs，通过定植于原发灶以外的器官最终导致肿瘤转移的发生。目前在结直肠癌中应用较为广泛的主要集中在术前或者术后以特定标记物(如CellSearch系统采用EpCAM和CK)捕获的CTCs的数量来作为手术预后评估的参考。
3．液体活检应用于结直肠癌化疗与靶向治疗
抗EGFRs靶向治疗是目前临床针对mCRC的一线治疗方案。2017 NCCN指南建议mCRC患者在制定抗EGFRs靶向治疗方案前应完成KRAS和NRAS的突变检测以指导临床用药方案的选择。BRAF突变可作为有效的预后指标，同时也有越来越多的证据提出BRAF突变是预示抗EGFRs靶向治疗反应不良的指标。肿瘤组织活检易受取材部位异质性的影响且具操作创伤性及种植转移风险，基于液体活检的RAS基因检测可有效规避上述问题。对于存在活检禁忌或操作风险较大的患者，可采用液体活检作为补充指导靶向用药。本实验室对20名mCRC患者外周血ctDNA(数字PCR)与组织标本(ARMs)的RAS基因检测进行比对。结果显示阳性一致率为71.43%(5/7)，阴性一致率为92.31%(12/13)，总体一致率为85%(17/20)。初步分析，2例阳性结果不一致是由于数字PCR检测覆盖位点有限，1例阴性结果不一致的原因可能是数字PCR敏感性高或是ctDNA更能反应肿瘤全貌。
抗EGFRs靶向治疗在结直肠癌中所引起的耐药与EGFR下游通路基因发生突变相关。ctDNA携带有肿瘤细胞遗传物质信息，检测外周血中相关基因(常见如KRAS、NRAS等)突变丰度可为临床耐药发生提供佐证，研究报道此方法较影像学检查提前10个月预测耐药的发生。Siravegna等通过BEAMing和数字PCR对mCRC患者ctDNA定基因的突变水平进行定量分析，揭示了药物治疗进程中肿瘤进化的动态过程，也为mCRC靶向治疗策略"Rechallenge Therapies"实施提供了依据。
除了ctDNA在mCRC患者靶向治疗中的应用，也有研究提出化疗前总cfDNA基线水平及化疗后CTCs水平也可作为mCRC患者化疗后无病生存期和总生存时间的良好预测指标。近来，针对CTCs检测技术的研究重心已自识别计数转向捕获培养串联单细胞测序、转录组及蛋白组研究等基础层面，未来利用CTCs的分子特征可为探寻肿瘤进化历程、建立基于CTCs库的药敏模型、指导临床用药决策以及新药研发提供科学的理论基础。
二．国内液体活检在结直肠癌诊疗中所面临的挑战
液体活检在结直肠癌诊疗中的应用前景无疑是广阔的。但我们应认识到，液体活检开展所需的检测平台、操作规范、人才培养和结果解释等环节均有别于现有常规分子诊断项目。综合当前液体活检技术在国内的应用现状及本实验室在技术研究与实际应用过程中的体会，笔者认为液体活检的临床应用之路还需直面以下几项挑战。
1.检测平台和技术种类繁多平台和技术种类繁多
肿瘤具有高度异质性且呈动态进化需要了解其突变全景。肿瘤相关的循环分子标志物微量且位点分布分散，需要对肿瘤多种变异形式准确的定性、定量检测，从而提供更精确的肿瘤遗传信息的全貌。ARMs(临床开展基础好)、数字PCR(高灵敏度和绝对定量)、BEAMing(mCRC相关临床研究应用最多)以及二代测序(通量高且可覆盖未知的基因改变)等检测平台各具特点。就结直肠癌而言，具备高通量特点且能够揭示未知基因改变信息的二代测序技术在这其中将具有更好的应用前景。而CTCs检测平台则主要存在分离识别技术的多样性与不统一的问题。无论最常见的抗原依赖技术(如CellSearch系统)亦或近来兴起的非抗原依赖技术(如密度梯度离心、膜过滤、介电电泳等)均有各自的局限性。因此在选择ctDNA与CTCs检测平台时，应基于临床应用需求(如靶标类型及分布情况、位点个数、已知或未知等)和检测平台特性(灵敏度和特异性、试剂类型和检测费用等)做出周全的考虑。
2.国内LDT尚需要****************顾发展与监管
当前应用于液体活检的多数检测平台如NGS、数字PCR和BEAMing，均采用实验室自建检测方法(LDT)。考虑到国内LDT的发展无论在项目数量还是监管制度的设立仍旧处于相对落后的现状。LDT项目进入临床应用之前需要检测部门的管理者以及相关监管部门充分重视。对于检测部门的管理者而言，应在现有的基础上，结合液体活检靶标"微量、片段化、性质相对不稳定"等特点，在项目开展前完成以下工作包括：性能验证和临床应用评估、室内质控体系建立、涵盖从标本采集到结果判断与解释全过程的规范化操作规程等。对于监管者而言，宜选择性的对具备资质的实验室放开部分LDT项目，采用诸如专家组定期督查、室间质量评价活动等多种方式来评估项目的安全性及有效性。总之LDT将有助于未来医疗诊疗水平的提高，我们应该在科学合理的监管下促进LDT的健康发展。
3.迈向临床尚需要更多临床研究的支持
在早期诊断方面，血浆mSEPT9已在国外成功开展数年，目前国内的临床应用推广也正逐步展开。在靶向治疗方面，一些针对个体或小规模队列的研究成果为我们提供了全新的临床应用思路，但短时间内进入临床应用之路并不平坦，仍需进一步扩展研究，提炼基于循证医学具有高置信度的临床证据，并做好对所得证据置信度的分级评估。获益于二代测序海量数据的新型临床试验"篮子/雨伞实验"也将为研究成果转化带来新的可能性。我们还应看到液体活检在非小细胞肺癌靶向治疗的应用已经取得可喜的成果。可视其为一种成功模式，作为结直肠癌研究成果临床转化的参考。以上需要包括临床医师、检测部门、体外诊断和制药厂商以及监管机构的多方协作，开展设计科学、入组严格和符合伦理规范的大型多中心研究。
4.亟需不同学科背景人才共同参与
液体活检的开展也对临床分子诊断工作团队的组成的提出了新的要求。在二代测序的应用地位在迅速提升的背景下，更需要来自不同学科背景、具备二代测序技术应用能力的人才。首先，二代测序的应用挑战体现在样本前处理与质控、建库方法的选择、Panel设定等。具备分子生物学专业背景的人才可在规范及个性化的应用中提供专业且有效的技术指导。其次，具有生物信息学背景的医学人才将有助于二代测序的数据处理和解读的工作。最后，具备临床背景和分子生物或遗传学背景的检验医师或者遗传咨询师可完成对测序结果全面且专业的解读，作为连接实验室与临床医师及患者的桥梁。
三．结语
液体活检的研究成果在结直肠癌临床应用中已经受到**************。早期筛查与诊断的应用已具备明确有效的循环分子标志物，在国内的临床应用推广正逐步展开。在手术预后评估以及靶向及化疗药物耐药分析等方面，一批小规模队列研究已见报道，还需要通过大型多中心研究加速其向临床应用的转化。我们应欣喜地看到液体活检在非小细胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌临床诊疗应用中的成功范例，并预见未来其在结直肠癌诊疗中广阔的前景。此行任重而道远，机遇与挑战并存。
