免疫治疗无疑是当下最热门最前沿的癌症治疗方法，而纳米颗粒介导的纳米疫苗是其中一个越来越重要的研究领域。产生肿瘤特异性的T细胞是纳米疫苗发挥作用的关键所在，这个过程涉及对抗原输送到淋巴结的时空控制、抗原在抗原呈递细胞（APC）中的胞质输送及其交叉呈递。目前研究表明小于50 nm的纳米颗粒更容易富集在淋巴结，但是迄今为止很少有50 nm以下的纳米颗粒可以在无佐剂的情况下促进抗原呈递并固有免疫反应，这也是目前的纳米疫苗组分复杂的最主要原因。
近日，来自美国德克萨斯大学西南医学中心的高金明（Jinming Gao）教授和美国国家科学院院士陈志坚（Zhijian J. Chen）教授等人发现，一种由酸度响应聚合物组成的纳米颗粒（PC7A）与抗原组成的简单复合物不仅可以有效促进抗原在抗原递呈细胞中的胞质输送、显著增强抗原呈递，还可以通过激活Ⅰ型干扰素因子（STING）产生Ⅰ型干扰素，从而显著增强该纳米疫苗的抗癌效应。相关工作发表于Nature Nanotechnology 上，共同第一作者为Min Luo博士、Hua Wang博士和Zhaohui Wang博士。
本文部分作者（从左至右）：Min Luo博士、高金明教授、陈志坚教授、Zhaohui Wang博士、Hua Wang博士。图片来源：University of Texas Southwestern Medical Center
高金明教授课题组早期致力于肿瘤早期诊断磁共振纳米探针的开发，近几年则致力于肿瘤微环境响应性诊断探针的开发与转化。该课题组此前曾开发出了一系列基于聚乙二醇-聚甲基丙烯酸酯、对生理环境pH（4-7.4）高度敏感的pH超敏纳米颗粒，已经成功用于肿瘤微环境诊断（Nat. Mater., 2014, 13, 204-212）及手术指导。考虑到该类纳米颗粒尺寸仅为20-50 nm，同时可以在特定pH条件下发挥质子海绵效应，破坏细胞膜，促进物质的胞质运输，他们推测这些纳米颗粒可能具有促进抗原胞质输送及运输至淋巴结的能力。因此他们先在小鼠体内评估了这些纳米颗粒产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应的能力。
他们使用卵清蛋白（OVA）为模式抗原，将之与纳米颗粒复合形成纳米疫苗并皮下注射到小鼠体内，然后通过体内CTL试验检测OVA特异性的CTL反应，发现纳米疫苗OVA-PC7A介导的OVA特异性脾脏细胞杀伤率最高（达82%），其杀伤效率是相同pH值响应的OVA-PC6S1A和OVA-PEPA的两倍，而线性氨聚合物中，OVA-PEPA产生的CTL反应最强，这表明聚合物结构和响应性pH值都对纳米疫苗产生的CTL强度有影响。同时，OVA-PC7A产生的CTL反应强度是OVA-alum或者OVA-LPS（均激活toll样受体4（TLR4）通路）的20倍，是OVA-CpG（激活TLR9通路）的3.6倍。此外它还可以产生OVA特异性的IgG1和IgG2c抗体，这意味着基于PC7A的纳米疫苗可以诱导产生强烈的抗原特异性CTL反应、Th1和Th2反应，效果甚至优于现有的成熟佐剂-抗原组合。
图1. 基于PC7A的纳米疫苗可以产生强烈的抗原特异性CTL反应、Th1和Th2反应。图片来源：Nature Nanotech.
为了示踪纳米颗粒在体内的运动，作者采用吲哚菁绿标记了PC7A纳米颗粒，在小鼠尾基部注射后采用活体成像研究了纳米颗粒的体内分布。他们发现纳米颗粒在注射后24小时可以到达外周淋巴结，而基本不分布到其他器官。通过使用荧光分子标记的OVA并采用流式细胞术分析淋巴结中OVA阳性的巨噬细胞和树突状细胞（DC），作者发现PC7A介导的OVA在所有细胞中的分布均多于游离的OVA。与游离OVA相比，OVA-PC7A使OVA阳性的CD8α+DC的数量增加了29倍，而该细胞对诱导CTL反应至关重要。进一步研究发现尽管骨髓来源树突状细胞（BMDC）对OVA-PC7A和OVA-PD5A的摄取能力相当（均高于游离的OVA），但是PC7A诱导的抗原呈递数量比其他两组高3倍，PC7A处理后的BMDC可以促使OT-I小鼠来源的CD8+T细胞产生IFN-γ的量明显增加，OVA-PC7A在体内产生OVA特异性的CD8+T细胞的数量也比其他两组高15倍。这些结果表明PC7A可以显著增强抗原在APC中的胞质输送和抗原呈递，从而显著增强产生的抗原特异性T细胞的量。
图2. PC7A纳米颗粒增强APC中的抗原胞质输送和抗原交叉呈递并CD8 T细胞反应。图片来源：Nature Nanotech.
由于共信号（CD80/86）和细胞因子也是诱导强烈肿瘤特异性CTL反应的必要因素，因此作者检测了纳米疫苗对APC共分子表达和细胞因子分泌的影响。采用纳米疫苗免疫后24小时，取小鼠的腹股沟淋巴结进行分析，发现OVA-PC7A后各种APC表面CD86的表达量均高于对照组，同时IFN基因（包括IRF7和CXCL10）的表达量也有所增加。和Poly(I:C)（阳性对照）及OVA-PD5A相比，OVA-PC7A在免疫后24小时诱导产生的免疫反应更强。通过在一系列基因缺陷小鼠体内进行相同实验，作者发现OVA-PC7A诱导的免疫反应并非依赖于TLR及线粒体抗病毒信号蛋白通路（MAVS），而是依赖于STING通路（注：TLR、MAVS和STING通路是APC中介导抗癌免疫反应的三个重要细胞信号通路），可能原因是PC7A直接和STING相互作用而激活STING。在这个过程中，APC（尤其是DC）是吞噬OVA-PC7A的主要细胞亚群，随后细胞内的STING-I型IFN信号通路被激活，从而增强了该纳米疫苗抗癌免疫反应。尽管作者认为还需要进一步实验确认PC7A激活STING的机制，但是并未在本文进行深入研究。
图3. PC7A纳米颗粒激活引流淋巴结中的APC并依赖STING的适应性免疫反应。图片来源：Nature Nanotech.
基于以上实验结果，作者采用几种肿瘤模型验证了该疫苗的抗癌疗效。在B16-OVA黑素瘤模型中，OVA-PC7A疫苗疗效最佳，植瘤40天后还有50%的小鼠存活，而单独的抗原组或者OVA-PD5A组的小鼠在20天左右就全部死亡。在B16-F10黑素瘤和直肠癌MC38模型中，抗原-PC7A疫苗组疗效均优于其他对照组。而在人状瘤病毒（HPV）E6/7 TC-1肿瘤模型中，抗原-PC7A疫苗可以使50%的小鼠在植瘤后60天的时间里保持无肿瘤状态。而将抗原-PC7A与抗PD-1抗体联合使用时，植TC-1肿瘤的小鼠在60天后全部存活，有90%的小鼠无肿瘤。同时，组织学分析发现PC7A纳米疫苗治疗的小鼠各器官未观察到明显的毒性。总体而言，该纳米疫苗可以在抗原用量较低（0.5 μg）的条件下产生较强烈而安全的抗肿瘤免疫反应，同时与免疫检验点抑制剂具有协同抗癌效应。
图4. PC7A纳米疫苗可以有效治疗各种肿瘤，同时与免疫检验点抑制剂具有协同抗癌效应。图片来源：Nature Nanotech.
——总结——
本文介绍了一种具有佐剂效应的新型疫苗，尺寸效应促进其淋巴结富集，而pH响应性促进抗原的胞质输送及交叉呈递。同时，研究人员发现PC7A具有结合STING的效应，因而该纳米疫苗具有较强的抗癌效应。
咋一看，能发现这样一个现象实属运气，但是事实上能够把这项研究做到发Nature Nanotechnology 的水平确实不能全靠运气。高金明教授实验室拥有一系列性质优良的聚合物，促使他们有机会发现PC7A具有促内涵体逃逸、促抗原呈递效应以及STING激活效应，这说明研究积累很重要；其次，高金明教授与陈志坚教授同在一个单位，恰巧后者是cGAP-STING信号通路研究大咖，每年均有2、3篇CNS文章到手，本文关于PC7A激活STING的机理研究算是手到擒来，这说明优秀的合作伙伴也非常重要。这一工作可谓是“天时地利人和”的结果。（不多说了，回去合成聚合物去了。另外，优秀的合作伙伴们，快到碗里来吧！在下这里有很多聚合物~~）愚愚学园
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