细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题
审评四部 王彦厚
摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
关键词：细菌内毒素检查、方法、验证
细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤
对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定
一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但**************用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。
研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。
样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。
内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。
内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。
大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考虑到几个药物联合用药问题，但一般情况下，药品中内毒素的含量远低于限值，并且药品生产厂家的内控标准严于注册标准，所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度（Maximum allowable endotoxin concentration）。
2、样品最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算
最大有效稀释倍数(MVD)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，对产品进行最大倍数的稀释，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许稀释的最大倍数。 MVD的计算公式为：当被规定的内毒素的限值以体积表示时， MVD=内毒素限值L（EU/ml ）/鲎试剂灵敏度（λ）；当内毒素的限值以重量或药品的生物活性(EU/mg或EU/u)表示时， MVD=内毒素限值L（EU/mg 或 EU/u）×供试品溶液的浓度C/ 鲎试剂灵敏度(λ)。在凝胶法中， λ=鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），在浊度法或显色法中, λ=所使用标准曲线上最低点的内毒素浓度（EU/ml）。
最小有效浓度（MVC）是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，将产品稀释到一定浓度，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许的最小浓度。计算MVC的一般公式为：MVC=鲎试剂灵敏度（λ）/内毒素限值（L）。对所选定的鲎试剂灵敏度来讲，MVC是一个绝对值；而MVD对特定的产品浓度是特异的，浓度变化时，MVD也会随之发生变化。
3、方法学验证试验的预试验
确定了样品的内毒素限值，考察了样品的溶解性，并且选定了一定灵敏度的鲎试剂，此时便可以考虑进行预试验。尽管法规中并不要求进行预试验，但在细菌内毒素检查法的建立过程中，一般需要进行预试验。预试验的主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度，也就是不干扰浓度（non-interfering concentration, NIC），为后续的验证试验选择适当的样品稀释度（或浓度）。
不管采用凝胶法还是光度法，预试验都是对一系列样品的稀释液进行试验，在每一个稀释浓度，都有一组添加内毒素的样品和一组不添加内毒素的样品，添加内毒素的浓度保持不变，而样品浓度会逐级稀释，但最终样品的稀释倍数不得超过MVD。可以采用直接把内毒素添加到样品溶液中，添加内毒素的体积宜小，以免导致样品溶液被稀释，一般添加体积等于或小于样品体积的10%为宜；也可以采用下述方法添加内毒素，就是将两倍于终浓度的内毒素溶液与两倍于终浓度的样品溶液等体积混合，内毒素和样品溶液间相互稀释，得到两者所需终浓度的混合液。添加内毒素的浓度，凝胶法为2λ；终点显色法为4λ（这里的λ表示标准曲线上的最低点，也就是方法的检测限）。动态显色法则有3种选择添加内毒素浓度的方法，可以选择标准曲线的中点浓度，也可以与终点比色法一样，选择4λ。此外，当样品稀释液中，内毒素的限值小于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为0.1-0.5EU/ml之间，当样品稀释液中，内毒素的限值大于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为1.0-5.0EU/ml之间。
对于凝胶法的结果判断，不添加内毒素的样品不应该凝集，如果发生凝集说明含有内毒素或内毒素样物质；添加有内毒素的样品应该出现凝集，若没有发生凝集表明样品凝集反应被抑制。光度法的结果判断标准为，测得的添加内毒素的量应该在已知添加量的±50%范围内，超出范围（多或少）表明存在增强或抑制作用。
通过预试验结果可以确定验证试验中样品的稀释度或浓度，其选择的基本原则包括：经稀释后的样品含内毒素的量应尽可能少，比其内毒素限值至少少4倍，最好检测不到内毒素。要求验证试验选择的稀释度至少要比NIC大1-2倍，但不可超过MVD。若样品需要多支合并进行验证试验，此时试验不可采用原来的MVD，因为假定合并样品中有一瓶存在污染，其它瓶没有污染，污染瓶
