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楼主  发表于: 2012-07-06 14:42

 镍柱的一些收获

管理提醒: 本帖被 老红 执行提前操作(2012-07-07)
做了这么长时间的有关蛋白的实验,突然想写写实验心得,来和各位生物领域的朋友做个交流。今天就主要讲讲镍柱吧。
说起镍柱,那我得从蛋白纯化方法开始讲了。蛋白纯化方法有很多,像亲和层析,蛋白沉淀,缓冲液更换,离子交换色谱,疏水作用,排阻层析,电泳等。各种方法各有优缺点,而且一些是配合着一起用。这里就该重点突出一下近30年来发展起来的金属螯合亲和层析分离技术,它基于目的蛋白与固相化的配基特异性结合而滞留,其他杂蛋白会流过柱子。而其中选用最广的是His-Tag标签蛋白,这是因为采用固定化金属离子亲和层析纯化His-Tag融合蛋白操作简便;N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制****************容,有利于蛋白表达;His-Tag非常小,不会改变目的蛋白自身的可溶性,相反一些大的标签蛋白如MBP,会大大提高融合蛋白的可溶性,尽管目的蛋白本身是不可溶或者折叠不正确;His-Tag非常小,在融合蛋白结晶后对蛋白结构没有影响等。
既然His-tag在实验中有如此的优势,那么His-tag亲和层析填料就不容被忽视。Hia-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用,其中镍离子是使用最广泛的。镍琼脂糖凝胶配基经典的是IDA,Ni-IDA螯合了三价,剩余三价,后来做Ni-NTA琼脂糖凝胶,因为它是螯合了四价,剩余是两价,所以在相同条件下洗杂质和目标蛋白的咪唑浓度Ni-TNA的要低,并且NTA的填料更稳定,能耐受更强的还原剂。当然IDA的载量要比NTA高些,但考虑到做蛋白纯化实验的话,主要是能得到更佳是实验结果,载量大小不是主要考虑因素,所以我更倾向于用NTA的填料来做。
目前德国的Qiagen的镍柱是公认很不错的,能说它唯一的缺点就是太贵了。因为有着镍柱做实验的需求,所以想试试看国内研发的一些镍柱。做了一些,效果总是没有Qiagen理想,不禁想,国内就真没有和世界知名品牌相媲美的生物产品吗?其实想想目前怎么说也是国泰民安,国家对生物领域的投入力度也更一步加大,再加上大量的科研人员和归国人员,理论上在中国能够形成大气候,不是现在也该快了。巧,我的这种想法很快被证实了,偶然间,实验室用了七海生物的镍柱,从实验结果看,七海镍柱产品质量和之前用Qiagen镍柱的一致。再加上又是国产的,价格公道,所以好感度又增加了不少。秉着在生物领域对专业的敏感度,我特地网上查了查七海生物的背景,看完他们的信息,也就明白为什么他们能做出这样好的产品了。同时也学习到上学时老师常教导的立大志背后的含义和付出,瞬时觉得做人这辈子有多长多短,有意义没意义的不就在这心态和过程吗?

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