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楼主  发表于: 2017-03-30 15:51

 基因编辑治疗杜氏肌营养不良,克服关键难题

胚胎发育是一个不可思议的复杂过程,在这个过程中数百万个分子和细胞事件陆续发生。然而,对于这个精巧的生物学过程,有时即使是单个核苷酸的改变也会严重地改变生活。

    杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,简称DMD)就是一个明显的例子。据统计,在全球范围内,每3500名新生男婴中就有1名罹患此病。由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因发生突变,肌肉细胞变得脆弱,肌肉被浪费掉,导致那些患病男孩在十几岁或二十几岁时死亡。

    DMD由单个基因中的突变引起,这使其登上基因治疗的候选名单。然而,dystrophin基因是最大的人类基因之一,长达2300 kb,有79个外显子,因此,传统的基因治疗方法束手无策,根本不可能将巨大的dystrophin基因包装到小小的病毒载体中。华盛顿大学的研究人员Jeff Chamberlain还表示:DMD是一种综合征,所有患者的突变都略微不同,需要多种治疗策略。

    既然替换基因不是一个好主意,于是研究人员现在转而采用CRISPR技术来编辑它。使用CRISPR来纠正dystrophin基因,需要细胞具有活跃的DNA修复机制,比如正在分裂的细胞。或者,在成熟的肌肉细胞中,CRISPR可以剪掉包含突变的那部分基因,而不修复它们,让细胞产生截短但有功能的dystrophin。

    基因替换治疗在眼下更容易实现,而且比基因编辑更加有效。不过,基因编辑具有巨大的潜力,并且随着更多的限制被解决,我认为这种方法将逐步用在患者身上,并最终获得批准,实现广泛应用,Chamberlain说。

    让小鼠动起来

    多年来,研究人员一直在研究DMD的治疗方法。他们探索了多种可能性,比如将产生肌肉的干细胞导入患者体内,用短版本的基因来取代有缺陷的dystrophin,使用药物促使DNA读*****机制跳过有缺陷的外显子,或探索各种基因编辑方法来纠正特定突变。尽管每一种方法都表现出一些希望,但许多结果都令患者和研究人员失望。

    当CRISPR登场时,它为人们带来新的希望,因为可以将向导RNA和Cas9的基因包装在病毒载体中,而不需要包装庞大的dystrophin基因。2014年,德克萨斯大学西南医学中心的Eric Olson团队使用CRISPR来纠正DMD小鼠模型中的dystrophin突变。在亲本的生殖细胞被处理之后,研究人员记录了小鼠幼崽中携带修饰基因的细胞百分比。

    生殖系编辑对人类而言是不可行的,但小鼠展现出的良好效果鼓励研究人员继续追求这方面的研究,改变策略以适应不再分裂的成熟肌细胞。Olson团队再接再厉,两年后利用腺相关病毒(AAV)载体将CRISPR元件导入DMD小鼠模型,删除错误的外显子,并去除一个移*****突变。他们在幼鼠出生后的不同时间导入载体,发现每种方法都能够恢复dystrophin蛋白表达,增强心脏和骨骼肌的功能。

    在同一期的《Science》杂志上,来自杜克大学的Charles Gerach团队和哈佛大学的Amy Wagers团队也利用CRISPR来删除相同的dystrophin外显子,并报告了肌肉功能改善。值得一提的是,Wagers的团队还发现这种方法能够纠正肌肉干细胞中的dystrophin,这意味着治疗效果有可能长期持续。

    这些文章基本上都采用相同的策略,来针对单个相同的突变,Chamberlain说。我们想看看是否可针对其他类型的突变,特别是那些并非最简单的情况。

    扩大CRISPR的潜力

    Chamberlain的团队决定试试CRISPR的潜力,用它来治疗另一种不同的小鼠模型。在这种情况下,纠正突变需要删除大段的基因组区域,或直接修复特定突变。

    Chamberlain解释道:目前在肌肉中实现基因编辑的唯一方法是利用AAV载体将CRISPR/Cas9导入肌肉。然而,这些载体进入全身的细胞和组织,特别是肝脏。因此,这种方法将大量的Cas9核酸酶导入肌肉和非肌肉细胞,在许多非肌肉细胞中带来长期的靶向和脱靶基因编辑。

    于是,Chamberlain的团队采用了一种肌肉特异的表达框,在不分裂的肌细胞中实现Cas9的表达,并设计了两种基因编辑策略。第一种方法是去除第52和53号外显子,它们编*****了dystrophin蛋白的非必需部分;第二种方法直接纠正第53号外显子的提前终止密*****子,以恢复全长蛋白的合成。

    这个团队最近在Nature Communications上报道了他们的成果,这些方法可以诱导肌肉特异的功能性dystrophin表达,从而改善小鼠模型的骨骼和心脏功能。我们的方法表明,基因编辑可应用于导致DMD的大多数突变,尽管也许不是全部,Chamberlain说。

    虽然距离DMD的有效疗法越来越近,但在大型动物和人类身上试验CRISPR基因编辑之前,研究人员还有几项重要的任务。Chamberlain表示:效率仍然需要改进,才能实现治疗水平的基因校正。此外,这种方法还要适应更多的突变类型。为了安全起见,脱靶编辑应尽量降低。最后,在第一波编辑发生后,应找到方法来降低Cas9核酸酶的活性。

    Chamberlain和他的团队正在挑战这些任务,以及探索dystrophin的不同突变,从而为基因编辑和替代系统提供更多的靶点。
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