KRAS突变的肺腺癌的靶向治疗代表了临床肿瘤的主要目标。KRAS基因本身已被证明难以抑制，而针对关键KRAS基因突变体的单一效应剂的有效性，受到被补偿或平行路径的影响，其效力被极大限制。我们通过系统的方法寻找并鉴定和曲美替尼（trametinib）组合的目标，trametinib是一种MEK抑制剂，得到美国食品和药物管理局批准，通过抑制KRAS下游的MEK来阻断通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导级联反应。通过短发夹RNA筛选，我们发现，trametinib引发成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）的代偿性反应，导致信号的反弹和适应性药物抗性。其结果是，在体外和体内实验中，FGFR1基因或药理学抑制作用与trametinib组合，增强肿瘤细胞死亡。此代偿反应显示明显的特异性：在KRAS突变肺癌和胰腺癌细胞中由FGFR1主导，但在KRAS野生型肺癌和KRAS突变结肠癌细胞中则没有被激活，或涉及其他机制。重要的是，trametinib处理的KRAS突变肺癌细胞和患者肿瘤显示出FRS2磷酸化，这是FGFR激活的生物标志物；这种增长是）通过抑制FGFR1废除和敏感性trametinib和FGFR抑制剂的组合有关。这些结果表明，FGFR1可以介导适应性trametinib耐受反应和验证用于治疗KRAS突变肺癌的组合方法。
筛选识别trametinib敏感的靶标
我们假设持续的MAPK抑制是必要的，但还不够。以KRAS突变的癌症为目标，我们进行了一个基于短发夹RNA（shRNA）的筛选试验用于识别目标基因，抑制这些目标基因能使KRAS突变的肺癌细胞对FDA批准的MEK抑制剂trametinib敏感化。
正如预期的，靶向必需基因（RPA1和CDK11A）的shRNA在空白组和trametinib处理的细胞中表现出强烈耗尽，而中性的非靶向对照shRNA（Renilla (REN)）保持不变（图1a）。将不同条件下平均四倍或更高倍数消耗作为筛选标准，我们比较了MEK抑制下的trametinib处理与未经处理的细胞，确定了对应于53个基因的64个shRNA（图1a）。其中，针对8个确定为匹配的基因shRNA，采用细胞竞争试验在KRAS突变的肺癌细胞系中进行验证，这些研究确定BRAF，CRAF，ERK2和FGFR1是我们筛选出的首要候选（图 1B）。
与其他MEK抑制剂相比，Trametinib具有优越的药理特性，因为它削弱ERK的反馈激活。不过，在我们的筛选结果中，MAPK组分被确定为匹配的事实暗示该途径活化最终还是发生了。事实上，尽管trametinib稳定抑制ERK信号达48小时（如果使用其他药物在这段时间内已经发生效力反弹），但是我们在使用药物后的6-12天内观察到磷酸化-ERK的增加（图1c）。这种反弹可以通过随后增加trametinib的浓度进行降低，这表明它是MEK依赖的。同时，ERK2，CRAF和BRAF可诱导的基因敲出可以阻止trametinib治疗后出现的ERK信号反弹并抑制细胞系生长（图1d）。类似的结果也出现在trametinib和ERK抑制剂SCH772984处理的KRAS突变的肺癌细胞中（图1e，f）。这些结果强调了KRAS突变的肿瘤与MAPK信号通路的显著相关性。与其它研究相一致，trametinib处理的KRAS突变细胞还显示出PI3K和JAK/STAT途径的代偿活化，分别表现为AKT和STAT3磷酸化（图1d，E，G。相对于STAT3磷酸化的短暂增加，AKT磷酸化是持续性的（图1G）。与他们对ERK信号反弹效应相反，在基因或药物层面抑制MAPK信号对trametinib诱导细胞中pAKT的影响不大。trametinib处理后多个信号通路的激活可能反映在缓解了KRAS基因突变的细胞的极度活跃的RAS信号所产生的多效性反馈机制。
图1 MAPK信号效应蛋白抑制和FGFR1使KRAS突变的肺癌细胞对trametinib敏感化
FGFR1介导的适应性耐药
已有几项研究工作涉及到RAS途径拮抗剂的适应性耐药。FGFR1的shRNA被鉴定为trametinib敏感目标，这增强了一种可能性：在trametinib处理的KRAS突变细胞中，FGFR1介导了MAPK和PI3K的激活。实验结果印证了这一可能，对KRAS突变肺肿瘤细胞系进行trametinib处理，增强了FGFR1途径中FGFR受体和/或配体的活化，这与FGFR适配器蛋白质FRS2的磷酸化增加的评估结果一致（图2a，b）。反过来，FGFR1的活化与增加的RAS-GTP，磷酸-AKT和磷酸-ERK的水平相关（图2b），FGFR1的敲除则能避免这种结果发生（图2c）。因此，FGFR1的shRNA不抑制KRAS突变的肺癌的增殖，但当与trametinib结合应用时，显示出协同抑制作用（图2d，e）。
FGFR1抑制和trametinib的组合效果呈现不同的特异性：例如，那些以FGFR1或FRS2为目标的shRNA，而不是以FGFR2和3为目标的shRNA，能够使KRAS突变的肺癌细胞对trametinib敏感（图2F）。相比之下，FGFR1敲除在KRAS野生型肺癌细胞对trametinib的敏感性上几乎没有影响（图2G）。而FGFR1的shRNA与trametinib协同处理在两个KRAS突变的胰腺癌细胞系中，表现出非常差的活性。重要的是，这种基因型和组织特异性与单一使用trametinib时能触发的FRS2磷酸化的能力相关。因此，使用trametinib治疗某些类型的KRAS突变的肿瘤，导致了对能促进适应性耐药性的FGFR1信号的依赖。
图2 FGFR1的反馈激活介导了KRAS突变的肺癌细胞对trametinib的自适应性耐药
FGFR1抑制增强了trametinib的效果
我们接下来要测试的是，trametinib与FGFR1抑制剂合用的治疗策略是否可以有效地治疗一些KRAS突变的肺癌，具体讲，使用trametinib和ponatinib，FDA批准的一种能够抑制FGFR1的多激酶抑制剂。Ponatinib对KRAS基因突变的细胞的影响不大，但能够抵消trametinib处理造成的pFRS2、pERK和pAKT蛋白的增加，并且与trametinib协同抑制癌细胞增殖（图3a-c）。在我们的研究中观察到，这样的组合在人类KRAS突变胰腺癌细胞和KRAS突变的鼠肺腺癌细胞中也显示出复合活性，但在KRAS野生型肺癌细胞或KRAS突变型结肠癌细胞（图3c）中的活性较小。重要的是，trametinib和FGFR抑制结合的敏感度与trametinib处理后pFRS2的诱导程度相关。
我们的基因和药理学研究确立了MAPK通路对trametinib适应性耐药的重要性，同时我们推断，PI3K / AKT信号的代偿性增加也起到了重要作用，并且ponatinib对其的抑制有助于提高这种药物组合的效果（图3d，e）。因此，ponatinib能够影响MAPK和PI3K途径重新活化的能力，有助于增强该药物组合在KRAS基因突变型肺癌细胞中的活性。
我们还测试了已知的抑制MAPK后重新激活的其他RTK，是否有助于KRAS突变的肺癌细胞对trametinib的适应性耐药。虽然trametinib处理H23和H2030细胞增加了MET和ErbB2（但不是EGFR）水平，但是在测试条件下这些激酶的靶向抑制剂不与trametinib协同作用（图3F）。与以前的报告相一致，EGFR/ERBB2双效抑制剂阿法替尼在某些KRAS突变的肺癌细胞系中也显示出与trametinib的组合活性，尽管在我们的研究中，其活性比trametinib和ponatinib的组合要差一些（图3F）。相应地，没有任何药物能防止trametinib处理后的ERK信号反弹（图3g）。因此，FGFR1信号的再活化是KRAS基因突变型肺癌细胞对trametinib适应性耐药的一个显著机制。
图3 Ponatinib与trametinib协同作用，抑制KRAS突变型肺癌细胞的增殖
MEK/ FGFR1抑制在体内的作用
我们在KRAS突变肺癌异种移植物、KRAS突变患者来源异种移植物（PDX）和遗传改造的小鼠模型（GEMM）中验证了我们的体外结果。应用空白对照、trametinib、ponatinib或药物组合处理异种移植物、PDX和GEMM模型显示了类似的结果，药物组合产生明显的肿瘤消退，没有明显的毒性（图4A-4C）。此外，组织学分析显示，在药物联合治疗的GEMM中出现肿瘤块的大量坏死现象，这在任何一个单独的药剂处理组中都没有观察到（图4d）。类似的结果在一个基于人类器官的、KRAS G12D基因驱动的胰腺癌移植模型中观察到，药物联合处理产生明显的细胞死亡并显著提高生存率（图4e）。
我们还研究了trametinib对KRAS突变的肿瘤中FGFR1信号传导能力。与体外的结果一致，1个KRAS突变型肺癌PDX模型显示trametinib治疗后，FRS2、ERK和AKT磷酸化随之增加（图5a）。此外，在2个KRAS突变型肺腺癌的患者中，trametinib治疗后FRS2磷酸化大幅增加（图5b）。这表明我们在临床前模型中得到的自适应抗性机制是与临床相关的。
图4 抑制FGFR1与trametinib组合处理导致KRAS基因突变型肺肿瘤的消退
图5 Trametinib诱导KRAS突变型肺肿瘤FGFR1信号传导
总结
总之，通过实施严格的阴性选择shRNA的筛选方法，我们确定了FGFR1信号的反馈激活，是一个在KRAS基因突变型肺癌中，针对MEK抑制剂trametinib的自适应耐药性的突出机制。我们的研究结果为trametinib与FGFR1抑制剂联合治疗KRAS突变的肺癌提供了强大的理论支持，并且确定了一种生物标记物，可能最终被用于识别其他可以从这种药物组合疗法中收益的患者。
