胚胎发育是一个不可思议的复杂过程，在这个过程中数百万个分子和细胞事件陆续发生。然而，对于这个精巧的生物学过程，有时即使是单个核苷酸的改变也会严重地改变生活。
杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，简称DMD)就是一个明显的例子。据统计，在全球范围内，每3500名新生男婴中就有1名罹患此病。由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因发生突变，肌肉细胞变得脆弱，肌肉被浪费掉，导致那些患病男孩在十几岁或二十几岁时死亡。
DMD由单个基因中的突变引起，这使其登上基因治疗的候选名单。然而，dystrophin基因是最大的人类基因之一，长达2300 kb，有79个外显子，因此，传统的基因治疗方法束手无策，根本不可能将巨大的dystrophin基因包装到小小的病毒载体中。华盛顿大学的研究人员Jeff Chamberlain还表示：DMD是一种综合征，所有患者的突变都略微不同，需要多种治疗策略。
既然替换基因不是一个好主意，于是研究人员现在转而采用CRISPR技术来编辑它。使用CRISPR来纠正dystrophin基因，需要细胞具有活跃的DNA修复机制，比如正在分裂的细胞。或者，在成熟的肌肉细胞中，CRISPR可以剪掉包含突变的那部分基因，而不修复它们，让细胞产生截短但有功能的dystrophin。
基因替换治疗在眼下更容易实现，而且比基因编辑更加有效。不过，基因编辑具有巨大的潜力，并且随着更多的限制被解决，我认为这种方法将逐步用在患者身上，并最终获得批准，实现广泛应用，Chamberlain说。
让小鼠动起来
多年来，研究人员一直在研究DMD的治疗方法。他们探索了多种可能性，比如将产生肌肉的干细胞导入患者体内，用短版本的基因来取代有缺陷的dystrophin，使用药物促使DNA读*****机制跳过有缺陷的外显子，或探索各种基因编辑方法来纠正特定突变。尽管每一种方法都表现出一些希望，但许多结果都令患者和研究人员失望。
当CRISPR登场时，它为人们带来新的希望，因为可以将向导RNA和Cas9的基因包装在病毒载体中，而不需要包装庞大的dystrophin基因。2014年，德克萨斯大学西南医学中心的Eric Olson团队使用CRISPR来纠正DMD小鼠模型中的dystrophin突变。在亲本的生殖细胞被处理之后，研究人员记录了小鼠幼崽中携带修饰基因的细胞百分比。
生殖系编辑对人类而言是不可行的，但小鼠展现出的良好效果鼓励研究人员继续追求这方面的研究，改变策略以适应不再分裂的成熟肌细胞。Olson团队再接再厉，两年后利用腺相关病毒(AAV)载体将CRISPR元件导入DMD小鼠模型，删除错误的外显子，并去除一个移*****突变。他们在幼鼠出生后的不同时间导入载体，发现每种方法都能够恢复dystrophin蛋白表达，增强心脏和骨骼肌的功能。
在同一期的《Science》杂志上，来自杜克大学的Charles Gerach团队和哈佛大学的Amy Wagers团队也利用CRISPR来删除相同的dystrophin外显子，并报告了肌肉功能改善。值得一提的是，Wagers的团队还发现这种方法能够纠正肌肉干细胞中的dystrophin，这意味着治疗效果有可能长期持续。
这些文章基本上都采用相同的策略，来针对单个相同的突变，Chamberlain说。我们想看看是否可针对其他类型的突变，特别是那些并非最简单的情况。
扩大CRISPR的潜力
Chamberlain的团队决定试试CRISPR的潜力，用它来治疗另一种不同的小鼠模型。在这种情况下，纠正突变需要删除大段的基因组区域，或直接修复特定突变。
Chamberlain解释道：目前在肌肉中实现基因编辑的唯一方法是利用AAV载体将CRISPR/Cas9导入肌肉。然而，这些载体进入全身的细胞和组织，特别是肝脏。因此，这种方法将大量的Cas9核酸酶导入肌肉和非肌肉细胞，在许多非肌肉细胞中带来长期的靶向和脱靶基因编辑。
于是，Chamberlain的团队采用了一种肌肉特异的表达框，在不分裂的肌细胞中实现Cas9的表达，并设计了两种基因编辑策略。第一种方法是去除第52和53号外显子，它们编*****了dystrophin蛋白的非必需部分;第二种方法直接纠正第53号外显子的提前终止密*****子，以恢复全长蛋白的合成。
这个团队最近在Nature Communications上报道了他们的成果，这些方法可以诱导肌肉特异的功能性dystrophin表达，从而改善小鼠模型的骨骼和心脏功能。我们的方法表明，基因编辑可应用于导致DMD的大多数突变，尽管也许不是全部，Chamberlain说。
虽然距离DMD的有效疗法越来越近，但在大型动物和人类身上试验CRISPR基因编辑之前，研究人员还有几项重要的任务。Chamberlain表示：效率仍然需要改进，才能实现治疗水平的基因校正。此外，这种方法还要适应更多的突变类型。为了安全起见，脱靶编辑应尽量降低。最后，在第一波编辑发生后，应找到方法来降低Cas9核酸酶的活性。
Chamberlain和他的团队正在挑战这些任务，以及探索dystrophin的不同突变，从而为基因编辑和替代系统提供更多的靶点。
