的抗原性早在100多年前已被科学家所发现。奥地利学者Landsteiner和俄国学者Metchnikoff于1899年各自独立试验,将豚鼠同种免疫,证实了具有抗原性并能诱发出特异性抗体,而且抗体能够抑制运动。1959年荷兰学者R毒性疫苗授予了专利,几十年来亦报道了不少蛋白具有抗生育效应,但迄今还没有动物实验显示一个单独的抗原能导致动物受孕率100%下降,目前尚未有成分研制成的避孕疫苗可在临床应用。在不育领域,虽然检测了ASA几十年,但实际上并不知道ASA处于何水平介导了不育,WHO于2010年颁布的分析手册(第5版)给出ASA阳性的临界值仍待证据。本文基于笔者三十多年的ASA检测实践及以往文献审读,对ASA介导不育的现状进行评价,以期增进ASA与生殖效应相互关系的深入认识。
1、ASA的检测
ASA的检测及其结果是认识免疫介导不育的前提。理想的ASA检测应该检出ASA存在与否、抗体类型、滴度水平以及抗体在表面的结合位置,而且检测方法须有高特异性、敏感度和重复性。尽管近三十多年发展的ASA检测方法甚多,但每种方法均有一定的局限性。不同的检测会有不同的结果判读以及相应的临床意义。此外,应用不同试剂厂商的产品,也会有不同的检测结果。
WHO手册推荐ASA检测采用混合抗球蛋白反应试验(mixedantiglobulinreactiontest,MAR试验)或免疫珠试验(immunobeadtest,IBT),以50%活动黏附有乳胶颗粒(或处理过的红细胞)或免疫珠作为ASA阳性的临界值。应注意的是,①WHO手册建议ASA阳性的临界值为50%活动黏附有乳胶颗粒或免疫珠,为什么不是40%或60%,实际上手册中抗体阳性的临界值仅是观点而巳,尚待广泛资料支持或修改;②WHO手册的ASA阳性临界值,1987年(第2版)的是10%,1992年(第3版)的是20%,1999年(第4版)和2010年(第5版)的是50%,抗体阳性临界值如此递增有何实验和临床依据?③男性的直接法检测的临界值是50%,女性的血清间接法检测的也是50%,免疫在男、女体内诱发抗体的机制并不相同,而采用一样的临界值是否合理尚需证实;④ASA为两类免疫球蛋白:IgG和IgA。这两类抗体对功能的干扰是不相同的,那么,IgG抗体的临界值是50%,IgA抗体的也采用50%,是否合理尚需实验支持;⑤ASA可以存在于膜表面,或者存在于血清、睾网液、精浆、宫颈黏液、卵泡液,但它们的抗体来源或途径并不相同,是否采用一样的临界值尚需研究;⑥虽然MAR试验和IBT都是一样的临界值,但是,MAR试验采用新鲜标本,而IBT采用洗涤过的,两者的方法学不同,检测结果并不总是一致的。故此,上述这些尚待认识的问题使得对ASA检测结果与患者的生育障碍的关系仍需进行大量研究,而且应结合其它相关临床和实验室检查作出慎重的解释。
2、ASA对生殖的可能效应
ASA可以通过多种机制在不同环节干扰正常的生殖过程,造成免疫不育,但是,ASA抑制生殖活动的具体机制尚未真正了解。
2.1ASA对睾丸发生的影响
上世纪50年代以来,对以免疫机制破坏睾丸功能进行了研究,实验性变态反应睾丸炎(experimentalallergicorchitis,EAO)可造成豚鼠、小鼠、兔等多种动物的生成缺乏,亦有采用睾丸匀浆加Freund佐剂注射于前列腺癌患者诱导出生成缺乏的报道,依此有观点认为ASA损伤睾丸发生。但是,男性体内ASA对生精上皮的效应,与睾丸炎对发生的作用机制并不相同。在血清或表面检出ASA阳性的不育男性,目前积累的资料包括本实验室结果显示,ASA不显著干扰曲细精管内发生。有3方面的证据:①先天性双侧输精管缺如患者,青春期启动发生,即由于输出通道缺乏而产生ASA,ASA在机体存在至成年生育期,这些患者的睾丸组织活检多显示正常或亚正常的生精上皮,睾丸取精后可使配偶建立妊娠,这表明ASA长期存在并没有显著抑制发生;②双侧输精管结扎的男性,ASA通常在数周后就出现,而且会有较高的抗体滴度,但输精管结扎的男性如果做复通术,可以检出不低的总量,同时显示较高的抗体水平但也没有严重干扰的发生;③本实验室检测了多例双侧输精管结扎超过30年的男性,结果其血清仍显示有ASA(未发表资料),这说明睾丸仍有产生,亦间接表明即使ASA存在了30年也没有导致生成缺乏。
2.2精索静脉曲张与ASA
精索静脉曲张症可降低男性生育力。研究表明,精索静脉曲张是男性不育的首位病因,发病率超过40%。精索静脉曲张可造成多项参数异常,有报道认为,精索静脉曲张不育患者会检出高的ASA发生率,国内文献甚至报告精索静脉曲张患者的ASA发生率超过80%。本实验室对精索静脉曲张不育患者的大样本检测结果显示,精索静脉曲张不会引致ASA产生,而且对一组精索静脉曲张患者长达20年的追踪检测亦表明,这组患者没有检测出ASA(未发表资料)。本实验室对ASA检出与其它文献报道的不同,或许涉及不同的检测方法学。
2.3流产与ASA
流产是妊娠常见的一种并发症,病因复杂,与免疫因素有关。成功妊娠与否不仅取决于母-胎之间的免疫平衡,还涉及机体一系列免疫学机制参与调节。对女性是一个同种异体抗原,以往研究对ASA介导流产有不同见解。有报道认为,女性受免疫后,体内有ASA可增加流产的风险,国内一些文献报道流产包括复发性流产者的ASA阳性率高于30%。另一方面,多项研究显示,流产与ASA无关。本实验室对流产者的ASA水平进行了检测,62例发生了早期流产妇女的ASA均为阴性,大样本及反复性流产者的ASA亦均为阴性(未发表资料),表明了流产不涉及ASA因素。可以推测:如果抗体能够对宫腔内的胚胎(如此大的细胞团)发生效应,使得胚胎发育异常,导致胚胎死亡、妊娠终止,抗体水平需非常高,而抗体水平确实如此高,抗体则在胚胎发生之前的生殖活动就该起效了,即受精不会发生,不至于在形成了胚胎,而且胚胎发育了这么久(数十日)后,抗体才对胚胎内的成分作攻击。
2.4ASA对宫腔内人工授精(IUI)的影响
IUI可以避免ASA对穿透宫颈黏液环节的影响,是治疗ASA不育患者的一种疗法。实际应用时,须考虑ASA的源性:男方的表面有ASA,还是女方宫颈黏液有ASA,或者是女方仅血清检出ASA。不同的抗体源性会有不同的疗效。女性局部尤其是宫颈黏液有ASA,可妨碍穿透宫颈黏液。这一效应取决于活力、浓度、抗体分子与表面抗原的亲和力,以及抗体在上的附着部位(头、尾,或两者)。对这类患者的治疗,采用IUI方式,将洗涤过的活动注入宫腔内,可以避开宫颈黏液对穿透的制约,但是,宫颈黏液若检出较高水平的IgA抗体,需检测血清循环抗体的状态,后者也是制约IUI疗效的因素。不育男性的表面结合有高水平的IgG抗体,亦多能检出IgA抗体,在穿透宫颈黏液时会发生颤动现象,不再迁移,采用IUI是可尝试的处理。然而,有些患者膜IgA抗体仍可干扰获能、精-卵识别等其它生殖环节,部分患者的还合并其它影响受精的结构或功能缺陷,故采用IUI治疗的效果也可能不大。本实验室观察到(未发表资料)仅血清检出ASA的不育女性,排除了内分泌、输卵管等因素外,处在阳性水平者施行IUI的疗效不高,很可能生殖道腔内也有较高的抗体水平,从而抑制了功能,导致授精失败。
2.5ASA对体外受精(IVF)的影响
IVF技术可以避开抗体的效应环节,是治疗ASA不育患者的有效方法。女方体内有ASA,IVF避免了体内抗体对功能包括运动、存活、受精等的不良效应,而且还可以避免抗体对胚胎早期发育的影响,IVF有较好的疗效。男方表面有ASA,既往大量文献和本实验室对ASA与IVF相互关系的研究显示:①ASA阳性组的受精率低于正常对照组;②膜表面抗体阳性的极少达到100%,总有部分没有抗体或结合的抗体水平较低,这些可具有正常授精能力,也能使卵子受精,即仅ASA的原因,一般情况下不会出现受精率为0。这2点提示:施行IVF疗法不能完全避免膜抗体对一些受精事件的影响,不过仍可以获得一定受精率以达到治疗的效果。
2.6ASA对卵胞质内注射(ICSI)受精的影响
ICSI治疗ASA不育患者可以获得较好的效果,受精率较IVF的高。值得注意的是,对表面有ASA(例如,双侧输精管先天性缺如患者或精道后天梗阻患者,这些患者体内有一定水平的ASA,其附睾表面会有ASA),ICSI注射的同时,实际上也将膜表面结合的IgA和IgG抗体带入了卵胞质内,可能引致ICSI受精后的胚胎碎片增多、胚胎发育不良。涉及的原因是多方面的,其中与某些膜蛋白抗体不影响受精却影响受精后胚胎发育有关,也可能原先附着在膜上的抗体蛋白随着精、卵原核融合而分布在合子核膜或合子细胞膜,或在合子细胞内,抗体蛋白与合子表达的蛋白发生相互作用,逐渐干扰了合子细胞或胚胎的正常代谢,导致发育异常。
若女性体内存在高滴度ASA,尤其是女性生殖道存在分泌型IgA抗体,即使经IVF或ICSI获得了受精卵,但胚胎移植后,女性体内高滴度的ASA在理论上还可能干扰胚胎发育:①在着床前胚胎发育过程,胚胎可能表达有一些与有交叉反应的胚胎抗原,女性体内的ASA会与这些胚胎抗原相互作用,导致胚胎发育异常和着床失败;②已被致敏的妇女,其体内ASA可以通过活化的淋巴细胞释放出细胞毒性淋巴因子,间接影响胚胎发育。故此,这类不孕妇女实施辅助生育治疗前,宜先降低其体内ASA水平,或者延长体外胚胎的培养时间,至胚胎发育晚些阶段再移植回体内,或许可以改善IVF成功率。
3、当前对ASA介导不育的认识偏差
ASA介导免疫不育的关系非常复杂,目前认识仍然有限。当前对ASA介导不育的认识偏差主要有以下问题:
3.1未认识ASA产生的前提
男性于青春期才开始在睾丸曲细精管管腔内有产生,故蛋白对男性机体免疫系统来说是外来抗原;女性发生可受到免疫,多次则可视作反复注入异体抗原的过程。但是,正常情况下,在男性体内不引起自身免疫反应,女性也不会因而对抗原产生抗的免疫反应,这是由于男、女性体内有多重免疫防御机制,避免了自身免疫或同种免疫反应的发生。如果免疫防御机制受到破坏或失平衡,使得及其可溶性抗原暴露于机体免疫系统,而且抗原是大剂量、持续地免疫系统,才可能激起对发生免疫反应,产生一定水平的ASA。所以,存在足量、免疫防御机制异常、持续作用于免疫系统,这三者是产生ASA的前提。有些研究未清晰认识ASA产生的前提。例如,有几项报道对1~8岁的男孩可检出不低的ASA发生率,实际上这些幼龄男童远未进入青春期,睾丸是没有生成的,检出的ASA是何来源尚待证实。还有一些文献报道,吸烟、非生殖系统炎症、海拔、气候等也会引致ASA阳性,而且发生率高。似乎很多因素都可以导致ASA产生,并且介导了不育,事实上并非如此。
3.2夸大了ASA对生殖环节的抑制作用
从发表的文献来看,似乎ASA在生殖过程的各个环节都可以干扰生殖活动,而且很多不育问题亦与ASA有关。实际上,ASA抑制生殖活动的具体机制尚未真正了解。有必要设计研究方案,严格控制标本性状和实验条件,阐明ASA对生殖活动的具体作用。本实验室的研究表明,参数异常、睾丸结石、隐睾史、血精、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等与ASA无关,月经期经常接触、慢性输卵管炎患者存在ASA产生的风险。
3.3夸大了ASA阳性率
ASA的检出与检测方法有直接关系。近5年国内发表的一些文献显示,不育患者的ASA阳性率多在15%~60%,甚至近90%都有报道。实际上,在一般的不育人群,是否存在男性超过5%、女性超过15%的ASA阳性率值得广泛的验证。开展不育夫妇ASA检测的实验室,应建立WHO的IBT和MAR方法进行ASA筛查,而且应购买可靠试剂商的免疫珠或包被了抗体的乳胶颗粒用于试验,以避免检测出现假阳性。
3.4夸大了ASA水平
WHO手册的IBT和MAR试验,ASA阳性的临界值是50%活动黏附有乳胶颗粒(或处理过的红细胞)或免疫珠。有些报道检出标本的ASA水平很高,有必要采用IBT和MAR试验进一步验证,毕竟高水平抗体阳性标本并不常见。若男性表面抗体阳性水平高,或女性的血清、宫颈黏液的阳性水平高,应同时检测IgG和IgA抗体,并进一步了解受检者的泌尿生殖道损伤史、感染史和体征,以及他们的习惯(或史),以认识高水平抗体阳性产生的可能原因,以便为下一阶段选择治疗方案作参考。
3.5夸大了一般治疗的效果
免疫不育的治疗策略主要有5类:①避免或减少抗原反复,使体内ASA滴度逐渐减退(如避孕套疗法);②免疫抑制ASA的产生(如类固醇激素疗法);③清除或减少表面结合的ASA(如应用物理、化学或生物方法处理);④避开ASA的效应环节,辅助受精(如IUI、IVF、ICSI);⑤中医中药的治疗。当前文献报道的ASA介导不育疗法有多种多样,疗效不一。应用IVF或ICSI治疗ASA不育患者有较好的疗效。有些报道采用一般的治疗获得了高的抗体治愈转阴率。是否简单疗法即可应用于免疫不育患者的治疗和获得好的疗效尚需:①采用标准化的ASA试验对受检者进行筛查;②诊断是否确为抗体阳性;③应评价该疗法针对哪一类抗体阳性患者,以及抗体处于什么滴度水平有疗效;④患者的治疗纳入标准,治疗前、后的对照均要严格设计,以增进对ASA治疗方法的认识。
4、结语
男、女性体内抗抗体可以降低生育力。ASA检测应作为不育症夫妇免疫学病因诊断的一项常规筛查。需建立WHO推荐的标准化ASA试验,解释ASA的结果及其与不育的关系要谨慎,不是所有的ASA都抑制了功能,而且ASA处于何水平对何生殖活动或环节起负效应尚需深入评价。有条件的实验室宜建立ASA亚阳性指标,为进一步的检查和治疗提供辅助参考。ASA与生殖的相互关系,现时仍有很多认识肤浅及尚待解决的关键问题,深入研究ASA发生和抑制生殖活动的具体效应,有助于阐明ASA介导不育的机理和发展有效的治疗方法。
