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楼主  发表于: 2018-06-08 13:22
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 关于细胞污染的那些事


相信很多人都有细胞培养失败的经历，辛辛苦苦的复苏、传代、换液、冻存，每个步骤都小心翼翼，可是到最后发现细胞的生长很不理想，但分析不出具体原因， 如果细胞比较珍贵又难以获得，那将给实验造成很大的损失。细胞培养中面临的一个很大的问题是细胞污染，细胞生长状态不好也许是你的细胞被污染了，今天给大家整理了一些关于细胞污染的相关知识，希望能对大家细胞培养有所帮助。
我们常见的细胞污染类型主要包括细菌污染、真菌污染、支原体污染。其中细胞被细菌污染后培养液会变浑浊，溶液PH值急速变化，对细胞生长影响明显，污染严重的还会导致细胞死亡。真菌污染的细胞培养液中会出现白色、浅黄色及黑色的小点。由于真菌生长的比较慢，等到发现有真菌感染的症状时候，其实细胞已经污染很严重了，很难救治。
细胞被支原体污染后细胞不会立即死亡，细胞培养液不会发生浑浊，并且污染初期阶段在高倍显微镜下观察其细胞形态也不会发生明显改变，需要花很多的精力去识别。因此细胞支原体污染难以察觉，具有极大的隐蔽性，对细胞的潜在的威胁更大。
现在已经被发现的支原体大约有200多种，其中细胞培养过程中导致污染的最常见支原体类型主要包括：猪鼻支原体（M. hyorhinis）、发酵支原体（M. fementans）、精氨酸支原体（M. arginina）、口腔支原体（M. orale）、人型支原体（M. hominis）、唾液支原体（M. salivarium）、梨支原体（M. pirum）和莱氏无胆甾原体（A. laidlawii）。根据报道，95%的细胞污染是由这8种支原体造成的。

  细胞一旦被支原体污染，就需要采取一定的方法清除，但各种清除方法均比较麻烦，且效果不确定，彻底清除是非常困难的，这是一个公认的棘手问题。如果污染细胞价值不大，应丢弃，重新培养；保持细胞培养不受支原体污染的最容易、最简单的方法就是做好预防措施。

由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养 都要进行支原体检测；欧洲药典规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测；美国FDA规定为了提高细胞生物制品安全性，需要进行支原体污染检测；中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测 。
  日常实验应提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。
培养法简单直观，一般需要培养28天才能判断是否有支原体的污染，工作量大。DNA荧光染色法操作较为简便，检测快速。但是该方法灵敏度比较低，因背景荧光的存在，细胞轻度支原体污染不易检出。
PCR方法由于引物设计特异性较强，可以进行种属的鉴别。比常规培养法检测时间大大缩短，比DNA荧光染色法具有较高的特异性，能够鉴别支原体的不同种。但最令人头痛的问题是PCR扩增产物污染，因为PCR产物拷贝量大，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
实时荧光定量PCR具有比PCR检测快，灵敏度高的优势，尤其适合样品模板含量较低时使用，实时荧光定量PCR能通过溶解曲线能够判断特异性扩增。实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，难以得到全面推广。

ATP酶法能够检测的支原体种类比较全，检测结果能够量化，容易判断，耗时短，整个实验过程需要20分钟左右。由于ATP酶法主要依赖支原体酶活性的发挥，任何影响酶活性的发挥都有可能影响结果的准确性，ATP酶法需要使用荧光分光光度计，且商品化的支原体检测试剂盒价格昂贵，大面积推广使用成本较高。通过比较实时荧光定量PCR、和ATP酶法可以看出，基于核酸扩增检测支原体的方法在其灵敏度和准确性上仍是支原体快速筛选检测的首要手段。因此，开发一种操作简便、特异性强、灵敏度高的基于核酸扩增的支原体检测方法是非常有意义的。市场上有代表性的几个检测试剂盒有美国的ATP酶法支原体检测试剂盒，PCR法支原体检测试剂盒，先达基因的支原体荧光检测试剂盒等。

希望以上的介绍大家能对细胞支原体污染有全面的认识，祝您快乐开启一段细胞生命之旅。
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1楼  发表于: 2018-06-08 13:24
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培养细胞日常做支原体检测还是很有必要的啊
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