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楼主  发表于: 2018-06-11 14:52天前

 有关细胞培养实验中的污染问题

 细胞污染是细胞培养技术中面临的主要问题。某些污染的发生往往难以察觉,污染会造成培养细胞生物学特性的改变,对实验结果造成潜在的威胁。培养环境中的物理化学及生物因素均有可能成为污染源。因此,认识细胞培养污染的途径及其危害性,建立细胞培规范的操作方法及规章制度,可以有效地防止污染保证实验体系的稳定性和可靠性。

 一、细胞培养的污染源  
细胞培养污染主要分为:物理化学性性的及生物性的污染。
1 物理化学性污染来源
 培养环境中的物理因素,如温度、放射线、振动、辐射会对细胞产生影响。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中,也可以引起细胞代谢发生改变,如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分,如氨基酸,若浓度超过了合适的范围,也会对细胞产生毒性。
2 生物性污染的来源
 外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、病毒、细菌、支原体都可能侵入培养环境引起污染。细菌、真菌或其它微生物污染的检测可以用不同培养基进行检查,支原体污染的检测需要特殊的方法。先达基因细胞支原体快速检测试剂盒,操作简单,20min出结果;结果准确,特异性强,可检测超过130种支原体;高灵敏度,可低至数十拷贝。病毒污染的检测可以使用许多体内或体外实验,包括大鼠或小鼠的接种、逆转录酶分析、凝血试验、红细胞吸附试验等。细菌和真菌的污染较易发现并及时清除,而大多数实验室对支原体的污染缺乏足够的认识,为了防止支原体及其它微生物污染的发生和传播,必须建立规范的无菌操作程序及各种规章制度。


2.1 支原体污染来源  
支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传播。细胞被支原体污染后,支原体可以与宿主细胞形成一个共生体系,使污染不断扩大。一旦发生支原体污染,支原体和其它微生物会随着飞沫而不断传播。操作过程中移液,倾倒液体时都会产生具有潜在感染能力的飞沫,并沉积在接触到的表面。这种污染性飞沫能存活数天甚至数星期。此外,操作失误引起的交叉污染也是支原体污染的一个常见途径。
人体的组织及体液成分是细胞培养中支原体污染的主要来源。污染的细胞中通常能分离到人类口腔支原体、发酵支原体、唾液支原体以及其它一些与人有关的支原体。无菌操作过程中,操作者能产生有污染性的随空气传播的飞沫和微粒,造成培养体系的污染。

二、 支原体污染的预防及控制  
实验室管理者应制定细胞培养的各项规章制度,每一个实验人员遵守。实验室负责人应根据情况,制定修改各项规范的操作程序及人员培训计划。实验中若发生污染或其它问题应有详细的记录,并由经验丰富的专家分析,找出哪个环节出了问题,包括培养液的配置、实验室环境的保持和无菌操作过程等,从而不断完善操作规程,避免类似问题的现。为了尽可能减少污染的发生,以常规检查的方式来监督是必要的。
2.1细胞库建立  
为了减少污染对细胞培养的影响,必须建立细胞冻存库。细胞冻存库应该分主细胞库和工作细胞库,当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。为了保证培养细胞系的完整性,必须进行详细的实验记录,应包括以下内容:细胞系的种类及来源、有无污染(如细菌,病毒,支原体) 、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变等。

2.2 支原体检测
 由于支原体污染并不引起细胞外观的明显变化,故常规的支原体检测非常必要的。人们可利用一系列直接或间接的方法检测支原体。但由于支原体种类的多样性,目前还没有一种方便、广谱、特异性高、准确的检测方法。
直接培养法是最敏感的,但也是最耗时的检测方法,大约需 28 天。从理论上讲,只需一个有活力的支原体就能在培养基上生长。但某些难以培养的支原体限制了直接培养法的应用。理想的直接培养法应采用多功能的培养基,以降低假阴性率。为增加对低滴度和低活力支原体检出率,应采用有氧和无氧两种培养条件及几种传代方式。直接培养法还需要活性支原体作为阳性对照,而且耗时,操作繁琐,因而不适于大多数实验室。检测支原体污染的间接法包括:PCR、ELISA、电子显微镜检查、DNA 探针、DNA荧光染色及生化分析法等。在选择 PCR、DNA 探针等方法前,应考虑好选择合适的靶序列及引物序列。最好的方法是利用不同的技术,多次检测,以弥补各种检测技术的缺陷,增加检测结果的可信度。


2.3 控制及排除  
控制支原体污染或其它生物性污染的唯一可靠的方法是所有可能污染的物品用高压蒸气灭菌法消毒。所有细胞培养设备都应消毒,应严格遵守上述的各项规章制度及监督制度,直至所有潜在的污染源都被消除。细胞一旦被支原体污染,要将它清除是非常困难的。由于一些不可复得的细胞被污染,人们不得不设法清除污染,挽救一些珍贵的细胞。
事实上,细胞培养过程中支原体污染不易察觉,细胞被支原体污染后清除非常困难,支原体污染的细胞在支原体被清除后,其细胞特性会发生很大改变,对研究结果造成严重影响因此,为了保证细胞培养体系免受污染的影响,关键是加强预防措施
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