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楼主  发表于: 2021-08-02 09:49天前

 Cdc42表达载体构建及协同药物对细胞迁移的影响

Cdc42全称为细胞分裂周期蛋白(cell division cycle42, Cdc42),属于Rho GTPases家族蛋白之一,在肿瘤转移和恶化中扮演极其重要的角色。由于Cdc42在细胞分裂调节和肌动蛋白细胞骨架重排中起重要作用,因此细胞生长、迁移、侵袭、极性和粘附都与Cdc42相关。Cdc42在细胞信号通路中充当分子开关,在细胞皮层之间从非活性的GDP结合形式转化为有活性的GTP结合形式,进而激活下游效应分子,以此对细胞外信号做出生理学应答。

在癌细胞细胞中过表达Cdc42突变体Cdc42G12V,会造成细胞生长阻滞,这说明Cdc42致细胞恶性转化的潜能与Cdc42-GTP和Cdc42-GDP之间的动态平衡有关。与GTPases家族的Rho和Rac蛋白一样,Cdc42也是潜在的研发抗癌药物的靶标,MiRNA和靶向Cdc42的小分子药物以及关联的信号通路,通过抑制Cdc42异常的过表达从而减缓癌细胞转移,为抗肿瘤药物的开发提供新的策略。拟肽是一类利用人工合成的物质模拟天然多肽的结构,或者利用构象性模板诱导相邻的多肽序列而形成的具有特异结构的化合物。我们前期药物合成实验,获得了一些拟肽化合物。在汉斯出版社《生物医学》期刊中,有学者拟构建含荧光报告基因的Cdc42真核表达载体,并初步探讨Cdc42协同拟肽化合物对细胞迁移的影响。

真核表达载体pDsRed-C1、pEGFP-C1、大肠杆菌感受态细胞DH5α、A549细胞和293T细胞均为本实验室保存。培养细胞所用材料均购自Gibico公司;限制性核酸内切酶购自Thermo公司;T4DNAligase购自Takara公司;ExTaqmasterMix购自康为世纪生物公司;CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所,质粒提取及胶回收试剂盒均为Omega公司产品;PCR引物合成及DNA测序由擎科生物公司完成。PMC4为我们前期合成,在R1位置处为-F取代基。

以pT-cdc42-2/3质粒为模板,分别使用其对应的引物PCR扩增目的基因Cdc42-2/3,PCR产物经EcoRI和BamHI两种酶消化后,连接到经相同酶切的真核质粒载体pEGFP-C1和pDsred-C1中,所得质粒命名为pGFP-cdc42-2、pGFP-cdc42-3、pRed-cdc42-2、pRed-cdc42-3。经菌液PCR、质粒PCR以及重组质粒双酶切鉴定分析其正确性。最后将鉴定成功的重组质粒送去测序公司精确鉴定。

Cdc42作为一类小GTPases,参与了众多的细胞生理过程。当有胞外信号刺 激细胞时,胞内的GEFs会被激活,活化的GEFs催化GDP从Cdc42上解离,GTP与Cdc42结合,Cdc42由于GTP的结合而被活化,活化的Cdc42与效应分子结合,导致多种信号级联的激活,调节细胞的增殖、存活、侵袭和迁移等过程。本研究中用的拟肽化合物PCM4,由本实验合成,针对的靶标是细胞膜上的整联蛋白。实验结果表明,过表达Cdc42后,细胞迁移率提高,当添加PCM4后,细胞迁移率进一步增强,推测PCM4可能在胞外与膜整联蛋白结合,刺 激胞内Cdc42的活化,进而通过Cdc42与效应分子结合,引起通过Cdc42介导的信号通路的开启,进而使细胞迁移率增强,具体机制有待于进一步研究。
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